凝胶层析凝胶层析柱

凝胶层析技术：基于分子大小差异的分离艺术

一、凝胶层析原理

凝胶层析，又被称为凝胶过滤层析，是一种利用带孔凝胶珠作为基质，根据分子大小来分离蛋白质或其他分子混合物的技术。其基本原理可以简述为：大分子不能进入凝胶颗粒的微孔，只能通过颗粒间隙快速流出；而小分子则可以自由进出凝胶微孔，在流动相和静止相间形成动态平衡，流出速度较慢。最终，不同大小的分子按照分子量从大到小的顺序实现分离。

二、凝胶层析柱的结构与规格

凝胶层析柱的设计精细，其要点在于柱体结构。直径虽然并不直接影响分离度，但在样品量大时增加直径可以提高效率（一般制备柱直径>2cm）。分离度主要取决于柱高，对于分族分离通常使用较短的柱子（20-30cm），而分级分离则需要更高的柱高（高达20:1至100:1的高径比）。滤板下的死体积应尽可能小，不超过总床体积的1/1000，以避免峰形拖尾。

在规格方面，常用的凝胶层析柱包括G25和G50等不同型号，其直径、高度、容量以及所用凝胶的量也有所不同。

三、操作要点详解

1. 装柱：选择均匀直径和高度的层析柱，底部放置玻璃纤维或棉花以增加稳定性。柱内先充满洗脱剂，然后缓慢加入凝胶悬浮液，让其自然沉降，确保无气泡或裂纹，并保持洗脱液始终浸过凝胶表面。

2. 上样：样品体积一般为凝胶床体积的10%（最大不超过30%），浓度宜高但黏度要低。将样品均匀加入凝胶床表面。

3. 洗脱：使用与平衡时相同的洗脱液，洗脱液体积约为凝胶床体积的120%。分部收集流出液以便进一步分析。

四、层析柱选择指南

选择合适的层析柱是实验成功的关键。分析型层析柱通常上样体积为0.3%-0.5%柱体积，柱高30cm（快速检测可用15cm）。制备型层析柱上样体积可达4%柱体积，柱高至少60cm。脱盐或缓冲液置换时，上样体积甚至可达30%。筛网孔径、填料粒径、耐压水平等因素也是选择层析柱的重要考虑因素。

五、清洗与维护

为了保证凝胶层析柱的性能和寿命，定期的清洗与维护至关重要。有效的清洗方法包括使用含NaOH的水溶液清洗不洁填料，用pH5.0-8的平衡缓冲液进行清洗。清洗效果可以通过磷酸沉淀试验和TOC检测（<500ppm）来验证。正确的操作和维护可以确保凝胶层析技术的稳定性和可靠性，为实验室带来更为精确的实验结果。